Бесплодия нет. Смешанная культура лимфоцитов

Иммунодиагностика бесплодия методом СКЛ

Диагностика заключается в определении реактивности лимфоцитов матери на антигены партнера методом смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ).

СКЛ проводится на 16-22 день МЦ (предварительная запись по тел.: 59-39-57).

Каждый четверг в 13:00 врач акушер – гинеколог (эндокринолог) высшей категории Квашнина Светлана Анатольевна проводит бесплатные консультации по методу СКЛ. (предварительная запись по тел.: 59-39-57).

Показания для проведения диагностики:

Первичное и вторичное бесплодие

Привычное невынашивание беременности

Регрессирующая беременность

Неудачные попытки ЭКО

HLA – совместимость супругов

Результат исследования – в течение 7-10 дней.

Механизм проведения исследования:

Этот тест состоит из набора культур, которые определяют степень распознавания супругами антигенов тканевой совместимости друг друга.

Лимфоцит - центральная клетка иммунной системы. Систему лимфоцитов можно сравнить с государством, где есть начальники и подчиненные, а каждый служащий выполняет специализированную функцию.

Если лимфоцит встречает любые чужеродные для организма объекты (бактерии, вирусы, чужие клетки и т. д.), то развивается иммунный ответ. Если речь идет о чужих тканях или клетках, то степень иммунного ответа будет зависеть от похожести конфигурации антигенов тканевой совместимости (HLA, human leucocyte antigens, или MHC, major histocompatibility complex, (это синонимы) антигенов).

Иммунный ответ выражается в появлении клонов (потомков одной клетки) клеток, строго специализированных к конкретным чужеродным факторам).

Другими словами, если иммунные клетки начинают реагировать на что-то, они начинают делиться. А деление клеток можно оценить по скорости синтеза ДНК. Чем больше синтезируется ДНК - тем сильнее делятся клетки, тем активнее идет развитие иммунного ответа. Степень синтеза ДНК можно определить по включению в культуру клеток радиоактивного нуклеотида тимидина - «кирпичика» ДНК.

На этом принципе основана оценка смешанной культуры лимфоцитов. Технически это делается следующим образом. У супругов берут кровь, из которой выделяют лимфоциты. Эти лимфоциты помещают в благоприятную для деления питательную среду. Если смешать лимфоциты разных людей, они начнут друг на друга реагировать. Однако если просто зарегистрировать активность смешанной культуры разных людей, невозможно понять, как реагирует конкретный человек, потому что «в бой» вступают клетки всех участников смешанной культуры. Для того, чтобы оценить индивидуальную реакцию каждого участника культуры, клетки одного из супругов подвергают воздействию, которое делает невозможным деление клеток. Однако антигенные свойства лимфоцитов при этом сохраняются. В такой культуре вся активность клеток будет связана только с живыми клетками другого супруга. Сравнивая различные комбинации культур живых и инактивированных клеток можно получить важную информацию о степени иммунологической похожести супругов.

Фактически в этом анализе, очень трудоемком, ставится 12 различных культур, а оценка реакции проводится на 3-и и 5-е сутки культуры. Полученные 24 цифры позволяют получить важную информацию о том, как будет реагировать женщина на антигены тканевой совместимости мужа во время беременности.

Дело в том, что сохранение беременности - активный процесс. Так же, как при реакции отторжения, для развития иммунологической толерантности на первом этапе важно адекватное иммунологическое распознавание пришельца. Если это распознавание вялое, или если оно происходит слишком поздно, зародыш атакуется естественными клетками киллерами матери и погибает.

СКЛ позволяет не только оценить состояние иммунологического распознавания лимфоцитов супругов друг другом, но и проконтролировать процесс лечения с помощью иммунизации лимфоцитами, выбрать метод и дозу иммунизации, оценить перспективы применения того или иного способа коррекции. Поэтому при обнаружении «плохой» конфигурации цифр в СКЛ, часто приходится ее повторять уже после лечебных воздействий.

Совместное культивирование лимфоцитов, имеющих молекулы МНС-II разного гаплотипа, вызывает их бласттрансформацию и пролиферацию. Реагирующие клетки относятся к Т-лимфоцитам и стимулируются чужеродными MHC-II детерминантами, расположенными на В-лимфоцитах, макрофагах. Сила реакции зависит от степени различия между антигенами гистосовместимости. Для оценки реактивности индивидуума в отношении аллельного варианта МНС готовят однонаправленную культуру лимфоцитов. Для этого клетки-стимуляторы предварительно обрабатывают митомицином или облучают, при этом стимулирующие клетки теряют способность к делению, но сохраняют жизнеспособность.

Реактивность в смешанной культуре лимфоцитов является од-ним из критериев в оценке клеточного иммунитета. СКЛ позволяет провести типирование HLA, подобрать пару донор-реципиент при трансплантациях тканей и органов, провести корреляцию между HLA-антигенами и определенными заболеваниями.

Для постановки реакции используют взвесь лимфоцитов, выделенных из крови пациентов (донора и реципиента). Отмытые отвечающие клетки суспендируют в небольшом количестве среды 199 (0,5 мл) и после подсчета количества клеток доводят до 0,6 * 10 6 клеток/мл. Суспензию стимулирующих клеток приготовят аналогично с добавлением раствор митомицина С (500 мкг митомицина С в 1 мл забуференного физраствора) из расчета 0,1 мл на 1 мл суспензии. Клеточную смесь инкубируют 40 минут при 37 °С на водяной бане, помешивая, затем к суспензии добавляют холодную среду 199 и трижды отмывают клетки при центрифунировании. Осадок суспендируют в питательной среде культивирования, доводя количество клеток до 0,6 * 10 6 клеток/мл.

В лунки стерильного круглодонного иммунологического планшета внесят по 0,1 мл клеточной суспензии в растворе Хенкса и добавляют 0,1 мл клеточной суспензии, несущей аллельные варианты МНС. В контроль добавляют такое же количество раствора Хенкса.

Учет результатов проводят после инкубировать клеток при 37 °С 3-5 суток в зависимости от постановки реакции с использованием морфологического или изотопного метода (см. РБТЛ).

При трансплантации костного мозга выбор гистосовместимого донора проводится по результатам HLA-типирования донора и реципиента, а также при определении совместимости отобранных HLA-идентичных пар донор-реципиент в СКЛ, которая является финальным этапом оценки совместимости. Для этого используется постановка двунаправленной реакции СКЛ с использованием культурального микрометода в 96-луночной планшете с оценкой величины пролиферации по включению радиоактивного Н 3 -тимидина в ДНК пролиферирующих лимфоцитов.

Возрастные ограничения к каждому тесту (есть ли референсные значения для детей или лиц старше определенного возраста – например: для теста 191 отсутствуют референсные значения для людей старше 80 лет).

При выдаче ответа на бланке бывают приведены референсные значения, соответствующие указанному полу и возрасту пациента.

В ИНВИТРО для некоторых тестов есть возрастные ограничения (поскольку референсные значения для определенного возраста отсутствуют), в медицинском офисе должны об этом предупредить. Ограничения чаще затрагивают детей младшего возраста. Надежные исследования по выработке референсных значений для детей этого возраста могут отсутствовать, а многие показатели в этом возрасте сильно отличаются от значений, ожидаемых у взрослых (дети – это не маленькие взрослые).

Что касается лиц старше 80 лет – если нет установленных референсных значений конкретно для этой группы, им, с определенной осторожностью, можно использовать референсные значения, полученные для наиболее близкой возрастной группы других взрослых.

Вам помог ответ на вопрос?

Да Нет

Почему при гемолизе некоторые тесты были выполнены? Почему не все тесты выполнены при гемолизе образца?

Гемолиз неодинаково влияет на разные тесты, поэтому результаты анализов, которые могут быть искажены гемолизом – не выдаются. Напротив, если влияние его на тест незначительно или отсутствует – результаты выдаются пациенту.

Гемолиз – это разрушение клеток крови с высвобождением их содержимого во внеклеточную жидкость (например, в сыворотку, плазму). Виной этому могут быть как процессы, происходящие в организме пациента, так и нарушение технологии взятия, транспортировки и обработки пробирок с кровью.

Высвободившиеся из разрушенных клеток вещества могут значительно изменить результаты некоторых тестов как за счет прямого воздействия на этапы анализа, так и за счет увеличения количественного содержания определяемого вещества. Влияние гемолиза на результаты анализа различно в зависимости от теста, прибора, методики выполнения и интенсивности самого гемолиза.

Вам помог ответ на вопрос?

Да Нет

Почему результаты разных лабораторий не совпадают?

Результаты одних и тех же тестов, выполненных в разных лабораториях в большинстве случаев, отличаются. Причина этого - индивидуальные особенности пациента, разные условия взятия биоматериала, методы выполнения теста и выдачи результата.
Первый фактор, который оказывает влияние на результаты – погрешность измерения. Это неизбежное закономерное отклонение результата исследования от идеальных показателей на всех этапах.

Биологическая - это естественные колебания количества тестируемого вещества в зависимости от индивидуальных особенностей организма пациента, факторов среды, терапевтических факторов и условий взятия биоматериала. Учитывая разницу во времени между двумя процедурами взятия биоматериала, а также то, что происходило в это время, могли измениться условия подготовки к анализу, само физическое состояние пациента, содержание некоторых веществ подвержено суточным ритмам, особенно подвержены изменению вещества в случае, если в это время шёл терапевтический процесс.

Аналитическая – колебания измеряемых показателей согласно законам физики и химии, которым подчиняются оборудование и реагенты. Учитывая особенности лабораторного процесса даже исследуя одномоментно две пробы одного и того же образца, мы не получим абсолютно одинаковых значений измерения.

Второй фактор, само лабораторное исследование – это сложный многоэтапный процесс, каждый этап которого состоит из 5-ти изменяющихся во времени и от лаборатории к лаборатории элементов:

1. Биоматериал, его свойства, условия доставки, хранения и обработки.
2. Персонал, его квалификация и действия.
3. Приборы, анализаторы, реагенты.
4. Методы организации работы.
5. Система контроля качества.

Сочетание всех этих составляющих отличается в разных лабораториях, и не может приводить к получению абсолютно «одинаковых» результатов.

Вам помог ответ на вопрос?

Да Нет

Насколько достоверны результаты исследований?

Результаты анализов, проводимых Инвитро, отвечают международным стандартам качества и признаны достоверными.

Достоверность результатов анализов – термин, характеризующий насколько полученный результат близок к истинному содержанию вещества в исследуемом биоматериале. Достоверность результатов анализов является частью понятия качества и складывается из многих составляющих.
Наибольший вклад в достоверность результата вносит подготовка к исследованию, а также правильность манипуляций с образцом крови, на этом этапе может происходить до 62% всех ошибок. Подтверждение, доставка и трактовка результата лечащим врачом может быть источником 23% ошибок.

Современная лаборатория может послужить причиной не более 15% всего количества возможных погрешностей, и эта цифра зависит от слаженности работы лаборатории, ее оснащения и установленных критериев качества.

Инвитро является крупнейшей в России частной медицинской компанией, и забота о качестве занимает в ней исключительно важное место. В Инвитро под контролем все этапы анализа - от взятия биоматериала до выдачи результата: работа медицинских офисов, курьерской службы, лаборатории – всё подчиняется единым правилам, т.н. стандартным операционным процедурам, где каждый шаг описан в мельчайших подробностях с целью исключить возможные ошибки.

Помимо многоуровневого внутреннего контроля качества, лаборатория Инвитро принимает активное участие в нескольких системах внешней оценки качества, сравнивая свои показатели с результатами других лабораторий. В 2016 году Инвитро подтвердила качество лабораторных услуг на международном уровне – в программе «Шесть сигм» компании «Westgard QC». Согласно заключению программы, количество возможных погрешностей в работе лаборатории не больше 3,4 на 1 000 000 случаев.

Признанием важности всей этой кропотливой работы в нашей стране стало вручение Премии Правительства РФ в области качества в ноябре 2017 г.

Большое внимание в настоящее время уделяется исследованию роли иммунных механизмов в репродуктивном процессе, поскольку их нарушение приводит к развитию бесплодия и раннему прерыванию беременности. Исследования иммунологических параметров и их взаимосвязи с репродуктивными процессами позволили сделать вывод о необходимости перестройки иммунной системы при подготовке организма матери к беременности, начиная с овуляторного периода, в момент имплантации эмбриона и в ранний период беременности.

Одной из наиболее сложных и трудно диагностируемых причин бесплодия и повторяющихся спонтанных выкидышей являются иммунные дисфункции.

С целью своевременного выявления иммунологическог о бесплодия в лаборатории иммунологии репродукции проводится обследование супружеских пар с использованием следующих методов диагностики:

• исследование уровня пролиферативного ответа лимфоцитов женщины на антигены партнера(в смешанной культуре лимфоцитов)
• определение активности блокирующих факторов в сыворотке крови женщины.
• оценка количественного содержания субпопуляций естественных цитотоксических клеток в периферической крови женщины.
• расширенная иммунограмма
• исследование содержания регуляторных клеток с супрессорной активностью в периферической крови.
• при выявлении клинических и лабораторных признаков иммунологическог о бесплодия пациентам рекомендовано проведение лечебной процедуры – аллоиммунизации лимфоцитами мужа, которая проводится в соответствии с индивидуальным графиком.

Консультация необходима:

• если при отсутствии гинекологических и эндокринных заболеваний при регулярной половой жизни в течении года нет беременностей.
• в случае повторяющихся(более 1раза) спонтанных прерываний беременности (выкидыше).
• при неудачных ЭКО в анамнезе.
• при угрозе прерывания настоящей беременности.

При выявлении нарушений с целью иммунокоррекции нарушений назначается процедура аллоиммунизации лимфоцитами партнера (АИЛ) . Данный метод лечения разрешен к применению Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения (лицензия ФС№2009/179 от 02.07.2009)

Процедура проводится только при наличии у партнера отрицательных результатов анализа на ВИЧ-инфекции, сифилис и вирусные гепатиты (В, С). Осложнения при АИЛ не выявлено. Метод АИЛ обладает выраженным иммунокорригирующим эффектом, повышает эффективность лечения бесплодия, как в естественном цикле, так и при экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО). Также назначается при неудачных попытках экстракорпорального оплодотворения.

АИЛ проводится 1 раз в 28-30 дней (в соответствии с менструальным циклом женщины) в 1-ую фазу цикла. Первый курс включает 3 процедуры АИЛ. После 2-ой процедуры пара повторно сдает контрольный анализ. При наличии позитивной динамики третья процедура АИЛ является последней. При отсутствии динамики — доза клеток для иммунизации увеличивается и проводится 2-ой курс, включающий 2 процедуры. После контрольного анализа в некоторых случаях необходимо назначение 3 курса иммунизации с увеличением дозы клеток. После достижения нормативных значений позитивный эффект держится в пределах 6-8 месяцев.

За период с 2003 по 2013гг. в лаборатории клеточной иммунотерапии было проведено около 3000 процедур аллоиммунизации лимфоцитами партнеров. Для данной процедуры из крови партнера выделяются только лимфоциты, которые всегда присутствуют в спермальной жидкости. В других странах* на протяжении 20 лет также проводится процедура аллоиммунизации, которая помогает женщине выносить и родить здорового ребенка.

Вид услуги	Цена, руб.
Тест трансформации лимфоцита (Выявление сесибилизации на 1в-во)	1650
Тест трансформации лимфоцита (Выявление сесибилизации на 2в-ва)	2 900
Тест трансформации лимфоцита (Выявление сесибилизации на 3в-ва)	3 900
Тест трансформации лимфоцита (иммунологическое обследование при бесплодии)	3 200
Иммунограмма расширенная с активационными маркерами	4 625
Комплексное исследование иммунного статуса	4 125
Вакцинация (аллоиммунизация лимфоцитами партнера 1 доза)	1 900
Вакцинация (аллоиммунизация лимфоцитами партнера 2 доза)	2 750
Вакцинация (аллоиммунизация лимфоцитами партнера 3 доза)	3 400
ИсследованиеCD16+/CD56+ лимфоцитов(иммунологическое обследование при бесплодии только НК-клетки)	1 250
Исследование макрофагальной активности (кондиционные среды макрофагов)	9 400
Исследование макрофагальной активности (кондиционные среды)	1 500
Криоконсервирование мононуклеаров для аллоиммунизации	650

СКЛ = смешанная культура лимфоцитов = MLC = mixed lymphocyte culture.Этот тест состоит из набора культур, которые определяют степень распознавания супругами антигенов тканевой совместимости друг друга.Лимфоцит - центральная клетка иммунной системы.Что такое СКЛ?И. И. Гузов, к. м. н., гл. врач Центра иммунологии и репродукции СКЛ = смешанная культура лимфоцитов = MLC = mixed lymphocyte culture.Этот тест состоит из набора культур, которые определяют степень распознавания супругами антигенов тканевой совместимости друг друга.Лимфоцит - центральная клетка иммунной системы. Систему лимфоцитов можно сравнить с государством, где есть начальники и подчиненные, а каждый служащий выполняет специализированную функцию.Если лимфоцит встречает любые чужеродные для организма объекты (бактерии, вирусы, чужие клетки и т. д.), то развивается иммунный ответ. Если речь идет о чужих тканях или клетках, то степень иммунного ответа будет зависеть от похожести конфигурации антигенов тканевой совместимости (HLA, human leucocyte antigens, или MHC, major histocompatibility complex, (это синонимы) антигенов).Иммунный ответ выражается в появлении клонов (потомков одной клетки) клеток, строго специализированных к конкретным чужеродным факторам). Другими словами, если иммунные клетки начинают реагировать на что-то, они начинают делиться. А деление клеток можно оценить по скорости синтеза ДНК. Чем больше синтезируется ДНК - тем сильнее делятся клетки, тем активнее идет развитие иммунного ответа. Степень синтеза ДНК можно определить по включению в культуру клеток радиоактивного нуклеотида тимидина - «кирпичика» ДНК. На этом принципе основана оценка смешанной культуры лимфоцитов.Технически это делается следующим образом. У супругов берут кровь, из которой выделяют лимфоциты. Эти лимфоциты помещают в благоприятную для деления питательную среду. Если смешать лимфоциты разных людей, они начнут друг на друга реагировать. Однако если просто зарегистрировать активность смешанной культуры разных людей, невозможно понять, как реагирует конкретный человек, потому что «в бой» вступают клетки всех участников смешанной культуры.Для того, чтобы оценить индивидуальную реакцию каждого участника культуры, клетки одного из супругов подвергают воздействию, которое делает невозможным деление клеток. Однако антигенные свойства лимфоцитов при этом сохраняются. В такой культуре вся активность клеток будет связана только с живыми клетками другого супруга. Сравнивая различные комбинации культур живых и инактивированных клеток можно получить важную информацию о степени иммунологической похожести супругов.Фактически в этом анализе, очень трудоемком, ставится 12 различных культур, а оценка реакции проводится на 3-и и 5-е сутки культуры.Полученные 24 цифры позволяют получить важную информацию о том, как будет реагировать женщина на антигены тканевой совместимости мужа во время беременности.Дело в том, что сохранение беременности - активный процесс. Так же, как при реакции отторжения, для развития иммунологической толерантности на первом этапе важно адекватное иммунологическое распознавание пришельца. Если это распознавание вялое, или если оно происходит слишком поздно, зародыш атакуется естественными клетками киллерами матери и погибает.СКЛ позволяет не только оценить состояние иммунологического распознавания лимфоцитов супругов друг другом, но и проконтролировать процесс лечения с помощью иммунизации лимфоцитами, выбрать метод и дозу иммунизации, оценить перспективы применения того или иного способа коррекции.Поэтому при обнаружении «плохой» конфигурации цифр в СКЛ, часто приходится ее повторять уже после лечебных воздействий.Использование СКЛ, которое было начато в нашем центре с весны 2000 г., позволило значительно улучшить качество лечение пациенток с бесплодием, невынашиванием беременности и неудачными попытками IVF.