Дифференциальное центрифугирование, замораживания. Центрифугирование в цитологии Метод дифференциального центрифугирования используемый в цитологии

Лейбих (циг. по С. Граник, 1962) установил, что в меристематических тканях железо необходимо для синтеза железосодержащих ферментов митохондрий; 82% его сосредоточено в хлоропластах, в ядрах найдены только следы. В то же время А.Ф. Агафонова, Н.С. Чаплыгина (1962), исследуя поглощение железа растениями и его распределение внутри клетки, приходят к выводу, что в клеточных ядрах паренхимы листьев кукурузы содержалось больше железа, чем в хлоропластах и структурах митохондриального типа. Содержание железа в последних было ниже, чем в хлоропластах.
В работе Дж. Скока (1962) приводятся некоторые данные о локализации бора в клеточных структурах. Автор указывает, что митохондрии и микросомы содержат меньше бора, чем ядра, пластиды и надосадочная жидкость. Для осуществления различных клеточных функций используется бор, содержащийся в диализируемой фракции надосадочной жидкости.
Мы совместно с З.М. Климовицкой, Л.Д. Лейденской и Э.В. Рудаковой в 1961-1953 гг. изучали локализацию микроэлементов марганца, молибдена и цинка в клеточных структурах растений, а также содержание микроэлементов в связи с онтогенезом растений. Был использован метод дифференциалы ого центрифугирования, дающий возможность выделить цитоплазму и органоиды клетки: ядра, хлоропласта, митохондрии. Мы придерживались методики выделения клеточных структур, предложенной Н.С. Сисакяном, И.М. Мосоловой (1961-1962).
В 1961 г. работу проводили на центрифуге с охлаждением и общей разрешающей способностью 30 000 g. Из гомогенатов листьев сахарной свеклы (сорт Верхнячская 020) в 0,35 M растворе сахарозы при 2500 g выделены крупные фрагменты клеток, при 4500 g - хлоропласта, при 17 000 g - митохондрии. Выделенные фракции сжигали. В полученной золе определяли марганец. Содержание его выражали в миллиграммах в пересчете на ту или иную фракцию, выделенную из 1 кг сырого вещества растении. Так, в крупных фрагментах клеток содержалось 20,88 мг/кг марганца, или 44,5%; в хлоропластах - 3,46, или 7,5; в митохондриях - 2,05, или 4,3; в незеленых цитоплазменных структурах - 20,43 мг/кг, или 43,7%. Препараты хлоропластов идентифицировали по их характерной люминесценции.
Максимальное количество марганца содержалось в незеленых цитоплазменных структурах и крупных фрагментах клеток. При пересчете на содержание марганца в золе каждой фракции максимальное количество его отмечено для фракции хлоропластов и митохондрий. В крупных фрагментах клеток содержалось 325,1 мг марганца на 100 г золы, или 16,3%; в хлоропластах - 823,9, или 42,5; в митохондриях - 500, или 25,1; в незеленых цитоплазменных структурах - 321 мг, или 16,1%, марганца.
В 1962 г. нами была принята следующая методика работы по изучению содержания марганца, молибдена и цинка в клеточных структурах листьев конских бобов и сахарной свеклы. Бобы (сорт Херц-Фрея) и сахарную свеклу (сорт Рамонская 04) выращивали на стационаре опытного хозяйства Института физиологии растений АН УССР на лугово-черноземной оподзоленной почве по фону NPK с добавлением марганца, молибдена и цинка. В начале, середине и конце вегетации мы брали навески листьев (30 г сырого вещества), затем их растирали на льду с 40 мл 0,5 M сахарозы и 10 мл фосфатного буфера (по Серенсену); pH среды 7,1. Полученные гомогенаты подвергали дифференциальному центрифугированию на центрифуге ТМ-14, разрешающая способность которой 20 000 g. Вначале из гомогенатов удаляли крупные фрагменты клеток. Затем на центрифуге при 1500 и 3000 g в течение 10 мин выделяли более мелкие фрагменты (осколки) клеток. Отмечено, что при 3000 g в течение 10 мин оседали ядра. Хлоропласты выделяли в течение 15 мин при 6000 - 10 000 g, а при 14 000 g - митохондрии. Выделенные фракции подвергали повторному центрифугированию с 2 мл сахарозы в течение 10-15 мин при соответствующих для каждой фракции значениях оборотов. Полученные фракции сжигали в муфеле, а в их золе определяли марганец, молибден, цинк. В оставшейся надосадочной жидкости также определяли содержание этих микроэлементов.
Фракции подвергали гистологическому анализу. Под микроскопом просматривали клеточные оболочки, ядра, хлоропласты. Митохондрии нам не удалось идентифицировать. У листьев бобов оказались очень тяжелые форменные элементы; это были преимущественно хлоропласты, которые при 3000-6000 g почти полностью осаждались. Надосадочная жидкость была прозрачной. У сахарной свеклы хлоропласты лучше всего осаждались при 6000-10 000 g. Совершенно прозрачной надосадочной жидкости не удавалось получить даже при 14 000 g. Этим, очевидно, объясняется отсутствие единой методики выделения клеточных структур. Разная степень оседания клеточных структур требует дифференцированных методик их выделения с учетом биологических особенностей каждой культуры.
Количество микроэлементов в клеточных структурах, выделенных методом дифференциального центрифугирования, рассчитывали в миллиграммах на 1 кг сырого вещества навески, в процентах от общего содержания и в миллиграммах на 100 г золы каждой фракции.
Из клеточных структур листьев сахарной свеклы максимальное количество марганца (при пересчете на фракцию, выделенную из 1 кг сырого вещества) сосредоточивается в надосадочной жидкости, т. е. в цитоплазме; в крупных фрагментах клеток (хлоропластах, ядрах, митохондриях) он содержится в убывающем порядке. К середине вегетации количество марганца в листьях сахарной свеклы (табл. 45) возрастает за счет увеличения содержания его в крупных фрагментах клеток и надосадочной жидкости. В органоидах клетки (ядрах, хлоропластах, митохондриях) оно остается довольно постоянным в течение всего периода вегетации.

Помимо микроскопии, другим основным и широко распространенным методом изучения клеток является дифференциальное центрифугирование или фракционирование.

Принцип метода состоит в том, что при центрифугировании развивается центробежная сила, под воздействием которой взвешенные частицы оседают на дно центрифужной пробирки.

После того, как в начале 40-х годов начали использовать ультрацентрифугу, разделение клеточных компонентов стало вполне реальным.

Прежде, чем подвергнуть клетки центрифугированию, их необходимо разрушить - разрушить жесткий каркас клеточных оболочек. Для этого используют различные методы: ультразвуковую вибрацию, продавливание через маленькие отверстия или самое обычное измельчение растительных тканей пестиком в фарфоровой ступе. При осторожном применении методов разрушения можно сохранить некоторые органеллы целыми.

При высокоскоростном центрифугировании крупные компоненты клетки (например, ядра) быстро оседают (седиментируют), при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. При более высоких скоростях в осадок выпадают более мелкие компоненты, такие как хлоропласты и митохондрии.

То есть при центрифугировании компоненты клетки распадаются на фракции: крупные и мелкие, поэтому второе название метода? фракционирование. При этом, чем выше скорость и длительность цетрифугирования, тем мельче полученная фракция.

Скорость седиментации (осаждения) компонентов выражается с помощью коэффициента седиментации, обозначаемого S.

Этапы дифференциального центрифугирования: низкая скорость (ядра, цитоскелет), средняя скорость (хлоропласты), высокая скорость (митохондрии, ризосомы, микротельца), очень высокая скорость (рибосомы).

Фракционированные клеточные экстракты, называемые также бесклеточными системами, широко используются для изучения внутриклеточных процессов. Только работая с бесклеточными экстрактами, можно установить детальный молекулярный механизм биологических процессов. Так, использование именно этого метода принесло триумфальный успех в изучении биосинтеза белка.

Этот метод основан на различиях в скоростях седиментации частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью. Разделяемый материал, например гомогенат ткани, центрифугируют при ступенчатом увеличении центробежного ускорения, которое выбирается так, чтобы на каждом этапе на дно пробирки осаждалась определенная фракция. В конце каждой стадии осадок отделяют от надосадочной жидкости и несколько раз промывают, чтобы в конечном итоге получить чистую осадочную фракцию. К сожалению, получить абсолютно чистый осадок практически невозможно; чтобы понять, почему это происходит, обратимся к рассмотрению процесса, происходящего в центрифужной пробирке в начале каждой стадии центрифугирования.

Сначала все частицы гомогената распределены по объему центрифужной пробирки равномерно, поэтому получить чистые препараты осадков самых тяжелых частиц за один цикл центрифугирования невозможно: первый образовавшийся осадок содержит в основном самые тяжелые частицы, но, кроме этого, также некоторое количество всех исходных компонентов. Получить достаточно чистый препарат тяжелых частиц можно лишь при повторном суспендировании и центрифугировании исходного осадка. Дальнейшее центрифугирование супернатанта при последующем увеличении центробежного ускорения приводит к седиментации частиц средних размеров и плотности, а затем и к осаждению самых мелких частиц, имеющих наименьшую плотность. На рис. 2.3 изображена схема фракционирования гомогената печени крысы.

Дифференциальное центрифугирование является, по-видимому, самым распространенным методом выделения клеточных органелл из гомогенатов тканей. Наиболее успешно применяется этот метод для разделения таких клеточных органелл, которые значительно отличаются друг от друга по размерам и плотности. Но даже и в этом случае получаемые фракции никогда не бывают абсолютно гомогенными, и для их дальнейшего разделения применяют другие методы, описанные ниже. Эти методы, основанные на различиях в плотности органелл, обеспечивают более эффективное разделение благодаря тому, что центрифугирование осуществляют в растворах с непрерывным или ступенчатым градиентом плотности. Недостатком этих методов является то, что приходится тратить время на получение градиента плотности раствора.

Зонально-скоростное центрифугирование

Метод зонально-скоростного, или, как его еще называют, s-зонального центрифугирования, заключается в наслаивании исследуемого образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности. Затем образец центрифугируют до тех пор, пока частицы не распределятся вдоль градиента в виде дискретных зон или полос. Благодаря созданию градиента плотности удается избежать смешивания зон, возникающего в результате конвекции. Метод зонально-скоростного центрифугирования применяется для разделения гибридов РНК--ДНК, субъединиц рибосом и других клеточных компонентов.

Метод дифференциального центрифугированияМетод дифференциального
центрифугирования используется для
фракционирования клеток, т. е. расслоения их
содержимого на фракции в зависимости от удельного
веса различных органоидов и клеточных включений.
В результате центрифугирования компоненты
клеток выпадают в осадок из раствора, располагаясь
в соответствии со своей плотностью. Более плотные
структуры осаждаются при более низких скоростях
центрифугирования, а менее плотные – при высоких
скоростях.

1. Метод, с помощью которого органеллы выделяют из клеток, называют
фракционированием. Этот метод оказался очень плодотворным, дав
биохимикам возможность выделять разные органеллы клетки в
относительно чистом виде. Он позволяет, кроме того, определять
химический состав органелл и содержащиеся в них ферменты и на
основании получаемых данных делать выводы об их функциях в
клетке. В качестве первого шага клетки разрушают путем
гомогенизации в какой-нибудь подходящей среде, которая
обеспечивает сохранность органелл и предотвращает их агрегацию.
2. На следующем этапе клеточный гомогенат подвергают ряду
центрифугирований, скорость и продолжительность которых всякий раз
возрастает; этот процесс называется дифференциальным
центрифугированием. Разные органеллы клетки осаждаются на дне
центрифужных пробирок при различных скоростях центрифугирования,
что зависит от размеров, плотности и формы органелл.

Этапы дифференциального центрифугирования:

3. Образующийся осадок можно отобрать и
исследовать. Быстрее всех осаждаются такие
крупные и плотные структуры, как ядра, а для
осаждения более мелких и менее плотных
структур, таких, как пузырьки
эндоплазматического ретикулума, требуются
более высокие скорости и более длительное
время. Поэтому при низких скоростях
центрифугирования ядра осаждаются, а
другие клеточные органеллы остаются в
суспензии.

Этапы дифференциального центрифугирования:

4. При центрифугировании раньше всего и при
небольших (1-3 тыс. g)ускорениях осядут ядра и
неразрушенные клетки, при 15-30 тыс. g осядут
крупные частицы, макросомы, состоящие из
митохондрий, мелких пластид, пероксисом, лизосом
и др., при 50 тыс. g осядут микросомы, фрагменты
вакуолярной системы клетки.
Осадки можно исследовать с помощью
электронного микроскопа, чтобы определить чистоту
полученных фракций. Все фракции до некоторой
степени загрязнены другими органеллами. Если тем
не менее удается добиться достаточной чистоты
фракций, то их подвергают затем биохимическому
анализу, чтобы определить химический состав и
ферментативную активность выделенных органелл.

Центрифугирование в градиенте плотности

Сравнительно недавно был создан другой метод
фракционирования клеток – центрифугирование
в градиенте плотности; при этом
центрифугирование производят в пробирке, в
которой предварительно наслаивают друг на друга
растворы сахарозы все возрастающей концентрации,
а следовательно, и возрастающей плотности. При
центрифугировании содержащиеся в гомогенате
органеллы располагаются в центрифужной пробирке
на тех уровнях, на которых находятся растворы
сахарозы, соответствующие им по плотности.

Пояснение.

Гипотеза, предполагающая, что сходство некоторых мух с пчёлами защищает их от врагов, проверяется экспериментально

Ответ: 2

Можно ли считать простым совпадением то, что эти мухи отличаются от своих близких родичей-комнатных мух-и похожи на неродственных им пчел? Современные биологи усомнятся в этом и выдвинут гипотезу, что окраска этих мух возникла в процессе эволюции, поскольку сходство с пчелами давало им какое-то преимущество (изучением эволюции мы займемся в гл. 2). В чем может заключаться это преимущество?

Для того чтобы ответить на такой вопрос, нужны какие-то идеи или гипотезы, которые позволят объяснить сделанные наблюдения. Так, можно предположить, что сходство с пчелами защищает мух от поедания хищниками или же что оно позволяет мухам, обманув пчел, проникнуть в улей и полакомиться медом.

Следующий шаг состоит в том, чтобы разработать и провести эксперименты, которые позволят проверить выдвинутые гипотезы. Некоторые гипотезы для науки бесполезны, потому что их нельзя проверить. Например, гипотеза о том, что «хищники принимают безобидных мух за опасных пчел», не поддается проверке, так как вы не можете узнать, о чем думает то или иное животное. Но даже если гипотезу можно проверить, это обычно не удается сделать непосредственно; надо прежде придумать какое-нибудь вытекающее из нее и поддающееся проверке предсказание.

Допустим, что вы на основе своей первой гипотезы (о том, что окраска мухи защищает ее от хищников) делаете следующее предсказание: если данный хищник был ужален пчелами и научился не трогать их, то он не станет нападать на муху, которая выглядит как пчела. Это предсказание можно проверить.

Для проведения соответствующего эксперимента нужен хищник, питающийся насекомыми. Таким хищником может быть, например, жаба, которая ловит насекомых, летающих или ползающих поблизости от нее. Если в садок с «неопытной» жабой, ранее не встречавшейся с пчелами, выпустить этих насекомых, то она поймает несколько штук, поймет, что они жалят, и откажется от дальнейшей охоты. Если затем, поместив в садок муху, имеющую полосатую, черную с желтым, окраску, мы убедимся, что жаба откажется от этой мухи, то, следовательно, наша гипотеза, согласно которой сходство мухи с пчелой спасает ее от хищников, подтверждается.

Но, быть может, пчелы здесь совсем ни при чем. Быть может, жабы просто не едят полосатых мух. Чтобы проверить это, придется использовать еще одну «неопытную» жабу. Если окажется, что жаба охотно пожирает мух в черную и желтую полоску, то, значит, вы получили дополнительное подтверждение гипотезы о том, что преимущество полосатого наряда мухи объясняется его сходством с окраской пчелы.

Настоящий научный эксперимент должен непременно сопровождаться контрольным экспериментом, который отличался бы от основного эксперимента одним (и только одним) фактором. В рассматриваемом здесь случае необходимо, чтобы обе используемые жабы практически не отличались друг от друга, т.е. принадлежали к одному виду, были одного пола, одного возраста и имели одинаковые размеры. Их следует содержать в одинаковых садках, при одинаковых условиях освещения, температуры, влажности и т.п. Единственное различие между ними должно состоять в том, что одна жаба до того, как ей предложат муху, уже имела возможность столкнуться с пчелой, а другой жабе такой случай не представился. Без контрольного эксперимента может возникнуть мысль, что жаба отказывается от полосатых мух по какой- то иной, не учтенной нами причине, например потому, что она не голодна, вы же делаете ошибочное заключение, что дело здесь в сходстве с пчелами. (Фактически вы можете провести еще один контрольный эксперимент, предложив первой жабе безобидную комнатную муху после того, как она откажется от полосатой мухи; это позволит проверить, действительно ли жаба сыта.)

Итак, вы провели хорошо поставленный научный эксперимент. Какие выводы вы можете сделать? Вернемся снова к гипотезе: «сходство мухи с пчелами защищает ее от хищников». Удалось ли вам доказать это? Нет; вы всего лишь показали, что одна жаба отказалась от полосатой мухи после того, как она научилась отказываться от пчел, тогда как другая жаба, никогда не имевшая дела с пчелами, поедала полосатых мух.

Исследователи не принимают результаты эксперимента до тех пор, пока не убедятся в их воспроизводимости. Возможность многократного воспроизведения результатов позволяет избежать ошибок. Достоверность результатов можно повысить, если многократно повторить эксперимент, используя большое число жаб и в точности воспроизводя те же условия. Сколько следует использовать жаб? Чем больше, тем лучше, но было бы непрактично (и утомительно) проводить эксперимент на всех жабах земного шара. На самом деле существуют статистические методы, позволяющие определить, насколько «надежны» результаты при данной величине выборки.

Вы можете также подвергнуть проверке предсказание о том, что окраска мух отпугивает «знакомых с пчелами» хищников; для этого следует проделать дополнительные эксперименты, используя вместо жаб лягушек, птиц, ящериц и других хищников, питающихся насекомыми. Чем больше альтернативных гипотез вам удастся опровергнуть и чем большее число разных хищников откажется от полосатых мух после близкого знакомства с пчелами, тем убедительнее вы докажете правильность своей гипотезы.

Гипотеза, подтвержденная многочисленными и разнообразными данными, полученными в результате воспроизводимых экспериментов, обычно считается теорией и в конце концов рассматривается как научно установленный «факт».